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2024-06-22 05:18
1. 充分脱蜡和水化。 脱蜡可以先60度20 min,再用二甲苯两次5~10 min;而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,这些以便后面的结合反应充分、均匀。 2. 把握好细胞通透的时间。 一般根据切片的厚薄,选择蛋白酶k的孵育时间,常用10~30 min,几um切片用短时间;几十um切片用长时间,通过摸索达到既不脱片,有能够使后面的酶和抗体进入胞内。 3. 适当延长TUNEL反应液的时间。 一般是37度1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度,选择更长的时间,可长至2 h,但要结合你最终的背景着色。 4. DAB显色条件的选择。 一般DAB反应10分钟左右,结合镜下控制背景颜色,最长不超过30 min;我不喜欢用promega公司提供的DAB液(桃红色),不利于辨认棕褐色。 5.PBS的充分清洗。 我个人认为,在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格,可增加次数达5次,因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。 6. 此外,内源性POD的封闭也十分关键。 对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织,我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度,可以达到很好的封闭效果,且不影响最终的特异性染色。南昌中洪博元技术部 |