蚕丝蛋白水解液怎样制备

1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 原辅材料 蚕丝、葛根、枳枸子、乌梅均购于徐州市场。

蔗糖、中性蛋白酶（130000 u/g）、胰蛋白酶（4000 u/g）由实验室提供，木瓜蛋白酶（650000 u/g）由广西海发生物酶制品厂提供。

1. 1.2 主要试剂 甲醛试剂、浓硫酸、浓盐酸、氢氧化钠、无水硫酸钠、无水氯化钙、氯水、邻二甲酸氢钾、甲基红、硫酸铜、硼酸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、食盐、731及723阴阳离子交换树脂和混合提示剂：1体积的亚甲基蓝和 2体积的甲基红指示剂的混合物。

1. 1.3 主要设备 电热恒温干燥箱、电热恒温培养箱、多功能粉碎机、低速大量离心机、架盘天平、磁力搅拌器、精密pH计、电子天平、数显恒温水浴锅、手提式压力蒸汽灭菌锅、电磁炉。

1. 2 实验方法 1.2.1 工艺流程 （1）采用酸解液调配饮料的工艺流程 蚕丝脱胶→酸解→阳离子交换树脂脱酸→丝素氨基酸 中草药→清洗→浸提→粗滤→离心 调配→ 香精、VC、蔗糖等 灌装→封口→杀菌→冷却→感官鉴评及卫生检测→成品 （2）采用酶解液调配饮料的工艺流程 蚕丝脱胶→CaCl2溶解丝素→酶解→灭酶→去CaCl2→丝素氨基酸 中草药→清洗→浸提→粗滤→离心→调配→灌装 香精、VC、蔗糖等 →封口→杀菌→冷却→感官鉴评及卫生检测→成品 1.2.2 蚕丝脱胶的方法 将洗净烘干后的蚕丝在Na2CO3溶液（0.4%，0.5%，0.6%）煮沸处理（20min，30min，40min），确定最佳脱胶条件。

1. 2.3 丝素酸解的方法 将脱胶后的丝素烘干做单因素实验。先选酸度为3M，固液比1∶50，111℃下酸解15h，测定每小时的氨基酸含量，可得到酸解时间的适宜范围；再选定固液比1∶50，酸解时间在以上确定范围内，110℃下采取1.0M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M、3.5M、4.0M、4.5M、5.0M等不同浓度酸解，可选出适宜的酸浓度范围；最后选定酸浓度与时间在适宜范围内，通过选定不同固液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，确定最适宜固液比范围。将得到的酸浓度、固液比、酸解时间分别在适范围内选3个水平做3因素3水平的正交实验，由此来找出最佳酸解条件。

1. 2.4 丝素在CaCl2中的溶解 配制不同浓度（30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、）的CaCl2溶液，测定丝素在其中的溶解效果，找出溶解丝素的CaCl2最佳浓度。

1. 2.5 酶解工艺的研究方法 （1）最佳水解酶选择。使蚕丝蛋白液在3种蛋白酶的最适加酶量、酶解温度、酶解pH值及相同酶解时间下进行酶解，比较3种酶的酶解效果，根据氨基酸得率选出水解效果最好的酶。

（2）酶解条件确定。根据以上实验所确定的最佳丝素蛋白酶，分别对底物浓度，pH值、温度确定3个水平做正交实验，以此来确定酶解最佳条件。底物浓度分别为4%、5%、6%，pH值分别为5.0，5.5、6.0，酶解温度分别为50℃、55℃、60℃。

1. 2.6 酸解液脱酸 采用732型强酸型阳离子交换树脂对酸解液进行脱酸，待流出液使茚三酮呈紫色反应时，停止上柱，用去离子水洗涤离子交换柱，至流出液近中性，再用0.5M氨水洗脱氨基酸，至不使茚三酮显紫色为止。

1. 2.7 中草药汁的提取 将洗净的中草药与纯净水按1∶10的比例在90℃水浴锅中浸提1h，得到虑液，再在残渣中加入8倍量的纯净水于90℃水浴中浸提0.5h，把滤液与残渣液合并后经低速大容量离心机离心后备用。

1. 2.8 饮料的调配 设计1个3因素3水平的正交试验来选择饮料的配方。为了对饮料进行评分，需按制品的色泽、香气、滋味和组织状态确定一个评分标准。

1. 2.9 饮料杀菌及卫生检测 饮料杀菌：将成品分别在90℃下杀菌15min、20min、25min，然后置于37℃恒温水浴培养箱中观察其稳定性，选择最佳杀菌时间。细菌总数的测定采用平板菌落计数法。

1. 3 检测项目及方法 蚕丝中粗蛋白的测定用微量凯氏定氮法。氨基氮含量的测定用甲醛电位法。

1. 3.1 丝素酶解液脱酸效果的检验 采用732型强酸型阳离子交换树脂，放入高40cm，Φ15的树脂柱中，待流出液使茚三酮呈紫色，说明树脂已饱和，氨基酸液流出，此时停止上柱，用去离子水洗涤离子交换柱，至流出液近中性，再用0.5M氨水洗脱氨基酸，至不使茚三酮呈色反应，说明氨基酸已脱尽。

1. 3.2 阴阳离子交换树脂去离子效果的检测 将用CaCl2溶液溶解后的丝素蛋白液选经过柱高40cm，Φ15的阳离子交换树脂柱去Ca2+，用NaOH溶液检测流出液中有无Ca2+，当无白色沉淀出现时，再经过柱高40cm，Φ15的阴离子交换树脂去除Cl-，用AgNO3检测流出液中有无Cl-，当无白色沉淀出现时停止上柱。

2 结果与讨论 2.1 蚕丝脱胶条件的确定 蚕丝中次要成分主要分布在丝胶蛋白中，为保证丝素氨基酸的质量，必须进行脱胶。丝素不溶于水，而丝胶是水溶性的。尽管丝胶有亲水性，但要在水介质中将它与丝素分离开来需很长时间，且要高温处理，为此采用Na2CO3作分离介质。其中丝胶蛋白脱去率（%）=丝胶液中蛋白质含量（g）×100%丝胶蛋白总量（g）。试验结果如表1。表1 Na2CO3解脱丝素蛋白正交实验设计方案及结果 处理 时间（min） 浓度（%） 丝胶脱去率（%） 1 1（20） 1（0.4） 48.5 2 1 2（0.5） 35.7 3 1 3（0.6） 59.8 4 2（30） 1 60.3 5 2 2 100 6 2 3 100 7 3（40） 1 73.9 8 3 2 100 9 3 3 100 由表1可以看出，在0.5%NaCO3溶液中中煮沸30min脱胶效好最好。在煮沸时为防止水分蒸分，影响NaCO3浓度，需在容器上加盖子。蚕丝脱胶后即为丝素蛋白，丝胶蛋白存在于水介质中。

2. 2 酸解单因子实验 用1g丝素在3M H2SO4，固液比1∶60，110℃下水解。从实验中发现丝素在H2SO4中3h才能完全溶解。测定4～15h的水解情况可知，氨基酸在8～10h含量较高，10h后变化很小，甚至开始减小。用丝素在固液比1∶60，110℃下酸解8h，比较不同H2SO4浓度与氨基氮含量的关系，结果酸解浓度太低或太高都会影响氨基酸含量，控制在3M～4M较好。用丝素在3M H2SO4，110℃下酸解8h，测固液比对酸解的影响，由于丝素至少1∶20的固液比才能浸泡，以此为最小固液比。结果固液比在1∶50～1∶70时水解效果最好。

2. 3 酸解正交试验 从酸解单因素实验中得知影响酸解的因素主要是酸浓度、固液比、时间，由此选定各因素的3个水平，实验结果如表2。表2 酸解正交试验结果与分析 所在列 A B C 因素 时间（h） 酸渡度（M） 固液化 氨基酸得率（%） 实验1 1（8） 1（3） 1（1∶50） 69.1 实验2 2（9） 2（3.5） 2（1∶60） 73.2 实验3 3（10） 3（4） 3（1∶70） 71.9 实验4 2 1 2 87.2 实验5 2 2 3 89.1 实验6 2 3 1 86.5 实验7 3 1 3 78.4 实验8 3 2 1 80.3 实验9 3 3 2 79.6 均值1 71.400 78.233 78.633 均值2 87.600 80.867 80.000 均值3 79.433 79.333 79.800 极差 16.200 2.634 1.367 由表2得酸解得率最高组合为A2B2C3，但从表4中得理想组合为A2B2C2，所以再做A2B2C2对照，结果测得丝素氨基酸得率为89.8%，比A2B2C3稍好，所以确定酸解最佳条件为酸浓度为3.5M，固液比1∶60，110℃下酸解9h。

2. 4 CaCl2溶解丝素结果 丝素在CaCl2溶液中的溶解特性较为特别，浓度低于35%或高55%时几乎不溶解，如表3，以40%为最佳。表3 CaCl2浓度与丝素溶解关系 1 2 3 4 5 6 7 8 CaCl2浓度 30% 35% 40% 45% 50% 55% 60% 65% 丝素溶解度 0 14.5% 100% 32.5% 15.5% 0 0 0 2.5 最佳水解酶确定 木瓜蛋白酶pH控制在6.0，温度为50℃，E/S=10%，底物浓度即丝素蛋白浓度为4%，进行酶 解。实验表明：前1h酶解速度增加很快，3h达到0.07mg/ml，以后增加缓慢。胰蛋白酶在pH8.0，温度40℃，E/S=2%，丝素蛋白浓度为4%下进行酶解。

7h达到最大值0.053mg/ml。中性蛋白酶在pH7.0，温度50℃，E/S=2%，丝素蛋白浓度为4%下酶解，3h达到0.065mg/ml。由此可知，木瓜蛋白酶水解效果最好。

2. 6 木瓜蛋白酶水解丝素蛋白正交实验 做正交试验确定木瓜蛋白酶水解丝素蛋白的最佳条件组合。木瓜蛋白酶最佳酶解条件为pH5.5，温度55℃，底物浓度为5%，加酶量为10%。最终1.001g丝素蛋白可得0.184g氨基酸。从丝素的酸解、酶解比较得出，酸解明显比酶解好。

2. 7 饮料调配 饮料的制作应注意风味的调整，影响本饮品风味的主要因素为氨基酸浓度、中草药浓度、糖浓度，因此设计1个3因素3水平的正交试验来优选饮料的配方。如表4。表4 饮料调配结果与分析 所在列 A B C 因素 氨基酸 中草药 糖浓度（%） 实验结果 浓度（%） 浓度（%） 实验1 1（0.3） 1（2） 1（8） 7.8 实验2 1 2（3） 2（9） 7.4 实验3 1 3（4） 3（10） 7.2 实验4 2（0.4） 1 2 9 实验5 2 2 3 8.5 实验6 2 3 1 8 实验7 3（0.5） 1 3 7.6 实验8 3 2 1 7 实验9 3 3 2 7.5 均值1 7.467 8.133 7.600 均值2 8.500 7.633 7.967 均值3 7.367 7.567 7.767 极差 1.133 0.566 0.367 由表4可得饮品的最佳调配配方：氨基酸浓度为0.4%，中草药汁浓度为2%，糖浓度为9%，再加少量水蜜桃香精及VC即得成品。

2. 8 饮品的贮藏稳定性试验 本试验在装罐前、后都进行杀菌，且对中草药汁进行离心，故得到的饮品澄清透明。在装罐后通过不同杀菌时间，观察其稳定性。分别在90℃条件下杀菌15min、20min、25min，冷却后置于37℃恒温培养箱内观察。

9d后均无变化，仍是澄清透明的黄褐色溶液。为了确定最佳杀菌时间，将保藏9d后的成品做细菌检测实验，结果是90℃杀菌25min细菌总数为56个/ml，满足国标要求。

3 产品质量标准 3.1 感官指标 色泽：黄褐色，均匀一致。风味：酸甜可口，有轻微的丝素氨基酸和中草药的苦涩味，无异味。组织形状：汁液透明，无杂质，久置后也无沉淀出现。

3. 2 理化指标 酸度：pH3.5～4.0，总菌数≤100个/ml，大肠菌数≤3个/ml，致病菌不得检出。

4 结论 丝素酸解比酶解的氨基酸得率高，酸解得率达89.1%，而酶解只有18.1%。由于酸解比酶解操作简便且水解液色泽、气味均较好，所以在制作饮料时采用酸解液。确定的最佳脱胶条件为0.5%的Na2CO3煮沸处理30min，在此条件下丝胶全部脱除且丝素没有损失。脱胶后丝素经洗涤烘干处理后进行酸解，得到酸解最佳工艺条件为3.5MH2SO4，固液比1∶60，110℃下水解9h，氨基酸得率高达89.8%。将阳离子交换树脂脱酸的氨基酸溶液与中草药进行调配，得到饮料的最佳调配方案为丝素氨基酸浓度0.4%，中草药浓度2%，糖浓度9%，VC浓度0.2%。由此制得澄清透澈、酸甜可口的黄褐色饮品。